پایان نامه ارشد درمورد کالوس، تمایز، اکسین

کشت در اتاقک رشد قرار داده می شوند. در اتاقک رشد 16 ساعت نور و 8 ساعت تاریکی تنظیم می گردد. البته بهترین دوره نوری برای ریزنمونه در محیط درون شیشه ای همان دوره نوری است که برای گیاه مادری مناسب است. در مورد بافت های بدون کلروفیل نیازی به وجود نور نیست، در صورتیکه ریزنمونه های کلروفیل دار جهت انجام فتوسنتز نیاز به نور دارند. برخی به غلط تصور می کنند که ریزنمونه در محیط درون شیشه در ظروف Co 2 در داخل ظرف کشت کم است، در حالیکه میزان Co ای به شدت نور کم نیاز دارد و میزان 2کشت به اندازه کافی وجود دارد. منبع تأمین نور در اتاقک کشت لامپهای فلورسنت هستند.
دما از دیگر عوامل مهم در اتاقک رشد می باشد. اکثر ریزنمونه های گیاهی در دمایی حدود 25 درجه سانتیگراد به خوبی رشد می کنند. البته گیاهان گرمسیری به دمای بالاتر (29-28 درجه سانتیگراد) و گیاهان پیازی به دمای کمتری (18 درجه سانتیگراد) نیاز دارند.
رطوبت نسبی اتاقک رشد نیز از عوامل مؤثر در رشد ریزنمونه است. معمولاً رطوبت نسبی اتاقک رشد بین 50-40 درصد تنظیم می شود. افزایش رطوبت موجب افزایش آلودگی های قارچی و کاهش آن موجب از دست رفتن آب ریزنمونه می شود.
تهویه مناسب و تأمین اکسیژن عامل مهم رشد سلولها و بافتها است. به همین جهت در صورتی که محیط کشت، مایع باشد باید آن را روی شیکر قرار داد و یا با استفاده از کاغذ صافی و ایجاد پل کاغذی، اکسیژن محیط کشت را تأمین نمود. در محیطهای کشت جامد با قرار دادن غیر قطبی ریزنمونه (به صورت وارونه) می توان اکسیژن مورد نیاز را تأمین نمود.
چون در محیط درون شیشه ای شدت نور کم و در نتیجه فتوسنتز پایین است، نیازی به افزودن Co2وجود ندارد
ومعمولاً بیشتر نیازگیاه به هیدرات کربن از طریق افزودن ساکارز تأمین می شود.
2-4-2- روشهای مختلف کشت بافت گیاهی
کشت بافت گیاهی که انواع روشهای کشت گیاهان در شرایط استریل را تحت پوشش قرار می دهد، بایستی در موارد خاص استفاده شود و تقسیم آن به انواع مختلف کشت امکان پذیر است که عبارتند از:
1- کشت بذر43 کشت بذور درون شیشه به منظور تولید گیاهچه یا گیاه کامل.
2- کشت جنین44 کشت جنین جداشده از بالغ یا نابالغ.
3- کشت اندام45 کشت اندام های جداشده گیاهی، که به انواع مختلفی از جمله، کشت در سیستم نوک، کشت ریشه و کشت دانه گرده قابل تقسیم است.
4- کشت کالوس46 کشت یک بافت تمایز یافته از ریزنمونه و اجازه دادن به آن برای تمایز زدایی و تشکیل بافت کالوس.
5- کشت سلول47کشت سلول های جداشده و یا توده های خیلی کوچک سلولی که در محیط مایع پراکنده می باشد.
6- کشت پروتوپلاست48 کشت پروتوپلاست های گیاهی، یعنی سلول های فاقد دیواره.
2-4-3- کشت کالوس
2-4-3-1 کالوس
کالوس یا پینه توده سلول پارانشیمی تمایز نیافته است. کالوس می تواند در واکنش به زخم، در محل بافتهای توموری، در محل جوش خوردن پیوند یا در محیط درون شیشه ای تولید شود. کالوس می تواند در تهیه پروتوپلاست، تولید جنین سماتیک، تولید اندامهای ریشه و ساقه و تولید متابولیت های ثانویه مورد استفاده قرار گیرد. برگ، اندام ذخیره ای (پیاز،غده)، گل و میوه از اندامهایی هستند که می توانند برای تولید کالوس مورد استفاده قرار گیرند. از جمله بافتها می توان به بافتهای پیش آوندی، مزوفیل برگ، لپه ها، دایره محیطیه ریشه و لایه آوندی اشاره کرد. معمولاً تشکیل کالوس در گیاهان دو لپه ای بیشتر از گیاهان تک لپه ای است. محیط کشت پایه که غنی از نیتروژن به خصوص نیترات و آمونیوم و فسفات است،LS تغییر یافته و محیط کشتMS یا MSتغییر یافته برای تولید کالوس مورد استفاده قرار می گیرد.
برای تولید کالوس قند های ساکارز یا گلوکز به مقدار 4-2 درصد (40-20 گرم در لیتر محیط کشت) به کار می رود. اسیدهای آمینه گلیسین و آرژنین تأثیر مثبتی بر تولید کالوس دارند، همچنین کازئین هیدرولیز شده به محیط کشت اضافه می شود. تنظیم کننده های رشد از جمله اکسین ها و سیتوکنین ها نقش به سزایی در تولید کالوس دارند. غلظت متوسط تا بالای اکسین ها از جمله اسید نفتالین استیک، اسید ایندول استیک و 2,4-D برای تولید کالوس ضروری است. از جمله سیتوکنین ها می توان به کینتین و بنزیل آدنین اشاره کرد که با غلظت کمتری نسبت به اکسینها، مورد استفاده قرار می گیرد.
محیط کشت جامد برای کشت کالوس دارای معایبی به شرح ذیل است:
1- در محیط کشت جامد، توده کالوس در سطح محدودی با محیط کشت در تماس است، در نتیجه مواد کمتری از محیط کشت جذب می کند و تعادلی در رشد در اثر مواد غذایی جذب شده، گازهای تبادل شده و فرآورده های پس مانده سمی بین کالوسو محیط کشت وجود ندارد.
2- در محیط کشت جامد تأمین اکسیژن کمتر از محیط کشت مایع است.
3- توده های کالوس در محیط کشت مایع به قطعاتی تقسیم می شوند و در سطح بیشتری تولید می شوند، در نتیجه جذب مواد غذایی از محیط کشت افزایش می یابد که در محیط کشت جامد چنین نیست.
4- در محیط کشت جامد، افزودنیهایی وجود دارد که باعث تسریع در تمایز می شوند و از رشد کالوس جلوگیری می کنند.
واکشت کالوس یعنی انتقال کالوس از یک محیط کشت به محیط کشت دیگر که به دلایل زیر صورت می گیرد:
1- تجمع مواد زائد در محیط کشت.
2- تخلیه مواد غذایی محیط کشت.
3- خشک شدن محیط کشت.
معمولاً اگر دمای اتاق رشد حدود 25 درجه سانتیگراد باشد هر 6-4 هفته یکبار لازم است کالوس به محیط جدید منتقل شود. کالوس ها پس از واکشتهای مکرر قادر به تأمین اکسین و سیتوکنین بوده و از این نظر خودکفا می شوند که به آن عادت کردن می گویند.
کالوسها از نظر رنگ و برخی صفات دیگر می توانند متفاوت باشند.کالوس ها از نظر رنگ به دو دسته تقسیم می شود: کالوس های تیره که دارای سایه های کرم، زرد، بژ یا قهوه ای می باشند و کالوسهای روشن که گاهی اوقات (نه همیشه) سبز هستند و ممکن است دارای رنگدانه های قرمز (آنتوسیانین) یا تیره (ترکیبات فنولی) باشند.
از نظر بافت نیز کالوس ها متفاوت بوده و برخی نرم و براحتی قابل جدا کردن هستند (کالوس هویج) و برخی سفت و محکم هستند (کالوس آنتوریوم). از نظرسرعت رشد نیز، کالوس ها متفاوتند و معمولاً بعد از گذشت یک تا چند هفته مقدار کالوس قابل مشاهده است. معمولاً مدت زمان دوبرابر شدن یک توده کالوس مستقر شده یک هفته یا بیشتر می باشد.
شاخص های متعددی برای ارزیابی کالوس ها وجود دارندکه از جمله آنها می توان به وزن تر، درصد وزن خشک، شمارش تعداد سلول، شاخص میتوزی کالوس و شاخص تنفس کالوس اشاره کرد.
2-4-4- هورمونهای گیاهی
2-4-4-1- اکسین ها
اکسین برای القای رشد و طویل شدن در سلول و به شکل متداول برای ریشه زایی مورد استفاده قرار می گیرد.متداول ترین اکسین ها عبارتند از 4،2 دی کلرو فنوکسی استیک اسید (2,4-D)، نفتالین استیک اسید (NAA)، ایندول استیک اسید (IAA)، ایندول 3- بوتیریک اسید (IBA).
IAA نوعی اکسین طبیعی است در حالی که 2,4-D، NAA و IBA اکسین های مصنوعی هستند.IAA در حضور نور به شدت تجزیه می شود در حالی که اکسین های مصنوعی به شدت پایدارند. دایکامبا49و پیکلورام50 نیز اکسین های مصنوعی هستند. دایکامبا برای تک لپه ایها و پیکلورام برای بقولات استفاده می شود.
2-4-4-2- سیتوکنین ها
ترکیبات اکسین به طور متداول در ترکیب با سیتوکنین، یعنی گروهی از تنظیم کننده های رشد که تقسیم سلولی و ساقه زایی را تشدید می کنند، مورد استفاده قرار می گیرند. ایزوپنتیل آدنین، 6 فوروفوریل آدنین که کینتین نیز نامیده می شود و بنزیل آدنین (BA) متداول ترین سیتوکنین ها در محیط کشت بافت گیاهی هستند. زئاتین و زئاتین ریبوزید دو سیتوکنین گران قیمت بوده و برای کشت های بافت گیاهی و سلولهای ویژه ای کاربرد دارند. تیدیازورون اخیراٌ با موفقیت برای پیشبرد باززایی گونه های چوبی مورد استفاده قرار گرفته است. با اعمال تغییراتی در نوع و غلظت نسبی اکسین ها و سیتوکنین ها در محیط کشت، امکان القای رشدهای تمایز نیافته و با ریخت زایی فراهم می گردد (Archana, G. 2002).
2-4-4-3- جیبرلین ها
جیبرلین ها طویل شدن ساقه را در چند گونه گیاهی تشدید می کنند و برای طویل شدن ساقه، پس از تشکیل جوانه در کشت بافت بعضی از گونه ها کاربرد دارد.
2-4-4-5- اسید آبسیزیک
اسید آبسیزیک بازدارنده رشد سلولی و القاگر خواب است اما احتمالاٌ تنظیم الگوی نموی را بر عهده دارد و نقش ویژه ای را در خلال مراحل اولیه جنین زایی رویشی ایفا می کند.
2-4-4-6- اتیلن
اتیلن ممکن است مانع رشد سلولی شود (Beyer, E. 1976) و روند پیری را در برخی کشت ها تسریع (Chen, D. 2000) و از تشکیل رویان جلوگیری می کند (Frame, B. 2000).
2-4-5- اسیدهای آمینه، آگار، pHو منبع انرژی
در بین ترکیبات آلی که در محیط کشت به طور اختیاری اضافه می شوند اسیدهای آمینه برای افزایش رشد سلول و باززایی گیاه مورد استفاده قرار می گیرند (Beyer, E. 1976). محیط کشت MS می تواند حاوی گلایسین به عنوان یک منبع نیتروژنی احیایی باشد. گلوتامین نیز به عنوان تنها منبع نیتروژنی برای چند گونه گیاهی قابل استفاده است (Ghosh, B. 1997). آگار در غلظت های 6/0 تا 8/0 درصد به کار می رود و غلظت های بالاتر موجب کاهش وزن تر و خشک و میزان ساقه زایی در محیط های کشت می شود (Grant, J. 1991). تفاوت هایی که در جنین زایی مشاهده می شود می تواند ناشی از عوامل ژلاتینی و محیط مایع باشد. pH محیط معمولاٌ با HCl یا KOH تنظیم می گردد. اتوکلاو محیط عموماٌ آزادسازی قندهای اسیدی را در پی دارد که سبب نزول اندکی در pH محیط می شود (Hadarami, I. 1993).
متداول ترین منبع انرژی کربنی مورد استفاده در محیط های کشت سلول گیاهی ساکارز است اما گلوکز و فروکتوز هم مورد استفاده قرار می گیرند (Frame, et.al 2000).
2-4-6- تمایز سلولی(Cytodifferentation)
سلولهای بافت کالوس طبیعت پارانشیمی دارند. در طی تمایز مجدد به یک گیاه کامل، این سلول ها بایستی به انواع مختلفی از سلول ها تمایز یابند. این تمایز مجدد در سلول ها به تمایز سلولی معروف است. در گیاه سالم تمایز بافت ها به روش ثابتی از خصوصیات اندام و گونه گیاه تداوم می یابد. معذالک کشت های کالوس از آنجا که فاقد عناصر آوندی هستند، برای مطالعه تأثیر انواع مواد شیمیایی و عوامل فیزیکی در تمایز بافت آوندی، سیستمی ارزشمند است. اکسین و ساکارز تأثیر عمده ای بر تمایز بافت های آوندی دارند، درحالیکه سیتوکنین ها و جیبرلین ها تمایز بافت آوند چوبی (Xylogenesis) را سرعت می بخشند. عموماٌ اکسین در غلظت پائین (5/. میلی گرم در لیتر) تولید آوند چوبی را تحریک نموده و ارتباط معکوسی بین غلظت اکسین و میزان تمایز بافت آوند چوبی دارد. بعلاوه مشاهده شده است که تأثیر اکسیژن بر تمایز بافت آوندی به نحو تنگاتنگی به حضور قندها بستگی دارد. همچنین فاکتورهای فیزیکی نظیر دما و درجه حرارت تأثیر شناخته شده ای بر تمایز بافت آوندی دارد (فارسی، م. ج. ذولعلی. 1384).
2-4-7- تمایز اندام
در طبیعت خاصیت توتی پوتنسی سلول های سوماتیکی در گیاهان مختلف دیده شده است. به طوریکه قطعات بزرگ ساقه و ریشه قادرند در اثر تمایز ساقه و ریشه تولید کنند. مطالعات در شرایط درون شیشه ای نشان داده است که خاصیت توتی پوتنسی به چند گونه اندک محدود نمی باشد و اغلب گونه های گیاهی اگر در شرایط مناسب قرار گیرند، تمایز نشان خواهند داد. برای باززایی یک گیاه کامل از یک سلول یا بافت کالوس، تمایز سلولی کفایت نمی کند و تمایز بایستی به شکل گیری جوانه ساقه یا جنین منجر شود. این امر با اندام زایی (Organogenesis) یا جنین زایی سوماتیکی تحقق می یابد. در اندام زایی، یک

مطلب مشابه :  دانلود پایان نامه درمورداصل موضوع، پیش فرض ها، کیهان شناسی

Leave a Comment