پایان نامه ارشد درمورد جنین، زایی، کالوس

ساختار تک قطبی که متصل به بافت آوندی اولیه در درون کالوس است تشکیل می شود ولی در جنین زایی یک ساختار دو قطبی بدون هیچ گونه اتصال آوندی با بافتکالوس مادری یا ریزنمونه شکل می گیرد (فارسی، م. ج. ذولعلی. 1384).
2-4-7-1- اندام زایی
در کشت بافت گیاهی اندام زایی فرایندی است که طی آن اندام های گیاهی نظیر ساقه، ریشه، جوانه گل و غیره تولید می شوند. این فرایند عبارت است از تولید اندام ها و جنین گیاهی (ساختارهای شبه جنین) از نقاطی غیرعادی نسبت به بافت مادری بر روی یک ریزنمونه سازمان یافته که فاقد هر سیستم از قبل تشکیل شده می باشد. ساقه ها و ریشه
های نابه جا از بافت هایی منشاء می گیرد که در حالت طبیعی این اندام ها را تولید نمی نمایند. ساقه های نابه جا ساختارهایی متشکل از ساقه و برگ هستند که از بافت های گیاهی در مکان هایی غیر از زاویه برگ منشاء می گیرند. نمو گیاه از طریق اندام زایی عبارت از تشکیل اندام ها با منشاء نابه جا یا منشاء مجدد می باشد. گیاه کامل باززایی شده با این روش، یک ساختار یک قطبی می باشد. این گیاه یک سری رشته های پروکامبیومی تولید می نماید که این رشته ها با شبکه آوندی موجود از قبل و گسترش یافته در بافت کالوس یا ریزنمونه کشت شده ارتباط برقرار می نماید.
فرایند اندام زایی از جنین زایی سوماتیکی متداول تر است و در تکثیر کلون به صورت انبوه پتانسیل خیلی بیشتری دارد و تولید گیاه به روش اندام زایی به دو طریق امکان پذیر است:
1- اندام زایی از بافت کالوس با منشاء مجدد
2- خروج اندام های نابه جا به طور مستقیم از ریزنمونه (فارسی، م. ج. ذولعلی. 1384).
2-4-7-2- اندام زایی از بافت کالوس
باززایی گیاه از ریزنمونه های کشت شده، مستلزم تولید کالوس های پایه و سپس تمایز جوانه ساقه از این بافت است. ایجاد ساقه، ریشه، گل آذین جوان، گلبرگ، جنین و … در شرایط درون شیشه ای صورت گرفته است. برای باززایی موفق گیاه در هر گونه و یا واریته معین ممکن است به ریزنمونه خاصی نیاز باشد. ریزنمونه های حاصل از اندام های بالغ و نابالغ را می توان در تهیه کالوس و سپس باززایی گیاه مورد استفاده قرار داد. با این حال معمولاٌ ریزنمونه های دارای سلول های فعال میتوزی، برای تولید کالوس مناسب تر هستند.
بافت ها و اندام های نابالغ در کشت درون شیشه ای از نظر مورفولوژیکی نسبت به بافت های بالغ انعطاف پذیرترند. اندازه و شکل ریزنمونه نیز مهم است.تعداد زیاد سلول در ریزنمونه های بزرگ تر، احتمال بدست آوردن یک کشت بادوام را افزایش می دهد. درصد کمی از سلول های ریزنمونه در تشکیل کالوس شرکت می نمایند. محل تشکیل کالوس معمولاٌ در سطح پیرامون ریزنمونه و یا در سطح بریده شده است. بافت کالوس در اثر ایجاد زخم و یا در پاسخ به هورمون های اضافه شده در محیط کشت ایجاد می شود.برای انتخاب ریزنمونه بایستی اندام های مریستمی نظیر نوک ساقه، جوانه جانبی، گل آذین، ساقه، برگ، دمبرگ و ریشه، بر سایر بافتها ترجیح داده می شود. چرا که این بافت ها دارای خصوصیات نظیر خصوصیات کلونی، بقاء کشت، سرعت رشد و خاصیت توتی پوتنسی در کشت های درون شیشه می باشد.مریستم ها، نوک ساقه و جوانه های جانبی، برگ ها و جنین های نابالغ، بویژه در غلات نیز ریز نمونه های خوبی هستند. ریزنمونه هایی نظیر برگ های بالغ، ریشه، ساقه، دمبرگ و اجزای گل، می توانند با موفقیت برای تولید گیاهچه به روش اندام زایی مورد استفاده قرار گیرند. فصل سال، سن و وضعیت فیزیولوژیکی گیاه والد نیز در موفقیت اندام زایی از کشت های سلولی سهیم اند. محیط کشت های مختلفی از جمله MS، B5، وایت و محیط کشت SH برای اندام زایی مورد استفاده قرار می گیرند. محیط کشت MS بر خلاف محیط های دیگر، محتوی مقادیر زیادی نیتروژن آمونیومی می باشد.
در روش اندام زایی معمولاٌ از دو نوع کشت سلولی استفاده می شود:
1- کشت توده های سلولی در سطح محیط کشت جامد
2- کشت سوسپانسیون سلولی در محیط کشت مایع
غلظت مواد تنظیم کننده رشد در محیط کشت برای اندام زایی بسیار مهم است. اکسین با غلظت متوسط تا زیاد اولین هورمون مورد استفاده برای تولید کالوس است. غالباٌ از هورمون 2,4-D که اکسین بسیار نیرومندی است به تنهایی برای القاء کالوس استفاده می شود. در بعضی از گونه ها غلظت زیاد اکسین و غلظت کم سیتوکنین در محیط کشت روند تولید کالوس را ترقی می دهد. سیتوکنین های مورد استفاده کینتین یا بنزیل آدنین می باشند. بافت کالوس متشکل از گستره وسیعی از انواع واکوئل دار با تمایز نامنظم است که تعداد کمتری سلول های مریستمی در بین آنها پراکنده می باشد. ماهیت بافت کالوس به بافت ریزنمونه و یا بافت هایی که ریزنمونه از آن منشاء گرفته است و همچنین ترکیب محیط کشتی که برای تولید و نگهداری آن به کار می رود، بستگی دارد. کالوس را می توان با تهیه واکشت های مکرر برای مدت زمان طولانی نگهداشت اما ترکیب و ساختار آن ممکن است به مرور زمان تغییر کند. چرا که محیط کشت به نفع سلول های معینی عمل نموده و باعث غالب شدن آنها می شود. تحت شرایط رشد مناسب برای رشد سازمان نیافته سلول های مریستمی به طور تصادفی و پراکنده در بافت کالوس قرار دارند. انتقال قطعات کالوس به شرایطی که موجب رشد سازمان یافته می شود به تشکیل مریستموئیدها که مراکز رشد نیز نامیده می شود می انجامد. مریستموئیدها توده های متمرکزی از سلول های شبه کامبیومی هستند که ممکن است به دلیل ظهور سلول های تراکئیدی در مرکز، به آوند نیز مجهز شوند. این توده ها محل تشکیل اندام در بافت کالوس بوده و قادر به تولید ساقه یا ریشه می باشند. اندام زایی هم از سوسپانسیون سلولی و هم از کشت های کالوس امکان پذیر است. فقط لازم است سلول ها را از محیط کشت کالوس به محیط کشت خاص باززایی انتقال داده و سپس به طور مرتب در محیط باززایی تجدید کشت نمود. بنابراین اندام زایی با اثر متقابل کمی تعیین می گردد. بعبارت دیگر مقادیر نسبی مواد و نه مقادیر مطلق آن ها در رشد و نمو سهم دارند (فارسی، م. ج. ذولعلی. 1384).
2-4-7-2-1- تشکیل اندام نا به جا به طور مستقیم
بافت های رویشی گیاهان عالی تحت شرایط ویژه قادر به تولید گیاهان نا به جا می باشند. جوانه های نا به جا آنهایی هستند که مستقیماٌ از یک اندام گیاهی یا یک قطعه متعلق به آن و بدون نیاز به کالوس (به عنوان مرحله حدواسط) منشاء می گیرند. تولید ساقه های نا به جا به طور مستقیم بر روی ریشه، برگ، فلس های پیاز یکی از روش های مرسوم تکثیر گیاهان است. در محیط کشت نیز این روش بویژه برای گیاهان علفی مناسب است. تشکیل اندام های نا به جا به فعالیت مجدد ژن های مرتبط با فاز جنین زایی و نمو بستگی دارد (فارسی، م. ج. ذولعلی. 1384).
2-4-7-2-2- جنین زایی
در جنین زایی سوماتیکی، جنین ها، سلول ها، بافت ها و یا اندام های سوماتیکی به طور غیر مستقیم (منشاء مجدد) یا مستقیم (منشاء نا به جا) باززایی می شوند که با فرایند جنین زایی زیگوتی جنین کاملاٌ متفاوت است. به طور کلی جنین های سوماتیکی آنهایی هستند که از بافت رویشی در محیط کشت تولید می شوند. جنین زایی سوماتیکی با اندام زایی متفاوت است زیرا جنین یک ساختار دوقطبی با انتهای ریشه ای بسته می باشد، ولی در اندام زایی یک ساختار تک قطبی تولید می شود. جنین از یک سلول منفرد منشاء می گیرد و فاقد ارتباط آوندی با بافت کالوس یا ریزنمونه ها می باشد. علاوه بر این القای جنین زایی سوماتیکی به یک محرک هورمونی خاص برای تشکیل یک ساختار دو قطبی که قادر به تولید گیاه کامل باشد، نیاز دارد در حالیکه در اندام زایی به دو محرک هورمونی مختلف، اول برای تولید ساقه و سپس برای تولید ریشه نیاز است. شارپ (Sharp) و همکاران در سال 1980 دو روش برای جنین زایی سوماتیکی توضیح دادند:
1- جنین زایی مستقیم: در این حالت جنین مستقیماٌ از بافت ریزنمونه و بدون رشد کالوس منشاء می گیرد. این جنین از سلول های اولیه معینی به نام سلول های تعیین شده اولیه برای تولید جنین ایجاد می شود.
2- جنین زایی غیر مستقیم: در این حالت جنین از بافت کالوس که از تکثیر سلول های ریزنمونه تولید می شود منشاء می گیرد. سلول هایی که به تولید جنین می پردازد سلول های تعیین کننده جنین القایی نامیده می شوند. از جمله این سلول ها می توان سلول های آبکش ثانویه در هویج، بافت های برگی قهوه، گل اطلسی، مارچوبه و … را برشمرد.
در اغلب موارد جنین زایی به روش غیرمستقیم می باشد. در این فرایند به مقادیر هورمونی مشخص و ایجاد شرایط ویژه برای شروع رشد کالوس و آماده سازی مجدد این بافت برای ورود به مرحله جنین زایی نیاز می باشد. فرایند جنین زایی رویشی مراحل مختلفی شامل تشکیل کالوس، نو جنین، بلوغ جنین و در نهایت تولید گیاهچه را در بر می گیرد. ترتیب محیط کشت های مورد استفاده و خصوصاٌ هورمونهای رشد نیز اهمیت فراوانی دارد. در بسیاری از گونه ها، یک محیط کشت برای تولید کالوس و نگه داری آن، محیط کشت دیگری برای بالغ شدن جنین سوماتیکی و محیط کشت سومی برای تبدیل این جنین به گیاه، لازم است. انتخاب ماهرانه ترتیب محیط های کشت در مواردی که جنین زایی سوماتیکی رخ نمی دهد و با مشکل انجام می شود ضروری است.
حضور اکسین در محیط کشت برای تشکیل جنین معمولاٌ ضروری می باشد. بافت ها یا کالوس هایی که به طور مداوم در محیط کشت بدون اکسین نگهداری می شوند، معمولاٌ تولید جنین نمی کنند. کالوس در محیط کشت غنی از اکسین تولید و تکثیر می شود. این محیط سبب تولید گروههای متمرکزی از سلول های مریستمی به نام توده های جنین زا (Embryogenic Clamps) می شود. تشکیل جنین های سوماتیکی معمولاٌ بعد از انتقال سلول ها یا کالوس ها به محیط فاقد اکسین یا دارای سطح کمتری از همان اکسین و یا سطح مشابه یا کمتر از یک اکسین ضعیف تر صورت می گیرد. بعد از انتقال به محیطی با اکسین کم یا فاقد اکسین، توده های جنینی به جنین بالغ تبدیل می شوند. در بعضی گیاهان بویژه گراس ها مراحل آغازش و نمو جنین در همان محیط کشت اول انجام می شود و انتقال به محیط غذایی دوم برای رشد جنین ها به گیاهچه لازم است.
جنین های سوماتیکی در محیط های کشت مختلفی از محیط کشت رقیق وایت گرفته تا محیط کشت غنی از نمک MS تولید شده اند، با این حال محیط کشت MS کاربرد وسیع تری داشته است. افزودن ازت احیاء شده به محیط کشت، هم به آغازش و هم به بلوغ جنین کمک می کند. از بین اسیدهای آمینه، فرم طبیعی اسید گلوتامین (L- glutamine) نقش ویژه ای ایفا می نماید. عامل دیگر کلات آهن در محیط کشت است. در غیاب آهن، نمو جنین از مرحله گلبولی شکل (globular) به مرحله قلبی شکل متوقف می شود. افزودن تنظیم کننده های رشد بویژه اکسین و یا اکسین به همراه سیتوکنین برای شروع رشد و القای جنین زایی الزامی است. از میان همه اکسین ها، هورمون 2,4-D و بعد از آن NAA بسیار مفید هستند.
از سیتوکنین ها نیز در محیط غذایی اولیه در خلال جنین زایی استفاده می شود. سیتوکنین ها در تسریع بلوغ جنین، بویژه در رشد و نمو کوتیلدون ها مؤثر هستند. در بعضی مواقع سیتوکنین ها برای رشد جنین و تبدیل آن به گیاهچه لازم است.
جیبرلین ها به ندرت در محیط کشت های اولیه استفاده می شوند. اما در بعضی از موارد نقش آنها در تسریع بلوغ جنین، تحریک ریشه دهی و مراحل بعدی رشد گیاه به اثبات رسیده است. نقش هورمون بازدارنده رشد ABA در جنین زایی سوماتیکی زمانی مشخص شده است که در مقادیر غیر بازدارنده مورد استفاده قرار گرفته است. این هورمون نمو و بلوغ جنین سوماتیکی را ترغیب می نماید و همزمان از تکثیر غیرعادی و ظهور جنین های فرعی و نا به جا ممانعت به عمل می آورد. افزودن آن به محیط کشت ممکن است بلوغ

مطلب مشابه :  دانلود پایان نامه ارشد درموردنماز جماعت، نفقه

Leave a Comment